Expressão Gênica, Transcrição, Tradução e Alterações Pós- Traducionais

Temática: Fluxo da Expressão Gênica

Independente da forma de vida a ser considerada, todos os seres vivos seguem o mesmo padrão básico pelo qual seus genes se manifestam. Essa ação é definida como Fluxo da Expressão Gênica, anteriormente conhecido como Dogma Central da Biologia Molecular, e rege os princípios básicos de diversas áreas do conhecimento biológico, como por exemplo a genética. A descoberta do modo de como os genes se expressam não ocorreu do dia para a noite e também não foi descoberta por um único cientista. Na verdade, a compilação desse processo é o resultado de décadas de duras pesquisas realizadas por centenas de estudiosos.

O princípio básico é que a informação genética contida nos genes (DNA) é passada para uma molécula de RNA mensageiro, o qual é traduzido, no citoplasma, pelos ribossomos em proteína. Fazendo-se uma analogia, podemos considerar que o DNA é a receita de um bolo.

Entretanto, essa receita está escrita em um idioma   desconhecido e está guardada em um local de onde ela não pode sair.   Como é impossível retirar essa receita desse recinto, fazemos uma cópia   dela em um pedaço de papel e a levamos para alguém que conheça esse   idioma e nos traduza. Essa tradução é o próprio bolo pronto. Assim, a   receita é o DNA, o local de onde ela não pode ser removida é o núcleo   celular, o papel que contém a cópia da receita é o mRNA, a pessoa que o   traduziu é o ribossoma e o bolo é a proteína. Entretanto, ainda faltam os   ingredientes. Esses são representados pelos aminoácidos. As pessoas qu foram buscar os ingredientes são conhecidas como tRNA (RNA   transportadores).

TRANSCRIÇÃO DO DNA

O DNA humano possui aproximadamente 2 metros de comprimento, caso esticado em linha reta. Nesse DNA encontramos entre 20.000 a 30.000 genes, cada um deles determinando a sequência de aminoácidos que encontraremos em uma proteína.

Para iniciar a transcrição gênica, a enzima RNA polimerase necessita reconhecer uma sequência específica de nucleotídeos conhecida como região promotora. Essa região é responsável pela iniciação do processo de transcrição gênica, sendo que ela pode estar livre ou recoberta por alguns fatores. Caso alguma molécula se ligue a ela, impedindo a ligação da RNA polimerase, dizemos que o gene está inativado. Isso é muito comum, uma vez que todas as células de um organismo possuem os mesmos genes, mas somente alguns são expressos por elas. Assim, a melanina é expressa em células do tecido epitelial (melanócitos) ao passo que nas células ósseas ela não é expressa.

A região promotora (em laranja) pode ficar próxima ou bem distante do gene que ela opera. Uma vez que a RNA polimerase se liga a essa região, ela desliza sobre a molécula de DNA até encontrar uma sequência específica de bases nitrogenadas, conhecida como sítio de iniciação, que determina o início da síntese da cadeia polinucleotídica de mRNA. Em eucariotos existem três tipos de RNA polimerases que atuam na síntese de mRNA. Elas são conhecidas como RNA polimerase I, II e III. A RNA polimerase I é responsável pela síntese de grandes RNAs ribossomais (transcreve as regiões do DNA que contém os genes para RNA ribossômico – rRNA), a RNA polimerase II é responsável pela transcrição dos genes que serão traduzidos em proteínas (RNA mensageiros que, por sua vez, serão traduzidos para a produção de proteínas) e a RNA polimerase III produz uma variedade de RNAs pequenos, incluindo o rRNA 5s e os RNAs de transferência. Todas as polimerases (DNA polimerase e RNA polimerase) somente sintetizam suas respectivas cadeias polinucleotídicas no sentido 5' → 3'. Portanto, como as fitas de DNA são antiparalelas, as polimerases “leem” a fitas 3' → 5', sintetizando, assim, uma cadeia complementar cuja sequência é 5' → 3'.

Não é somente a RNA polimerase que atua na produção do mRNA. Na verdade ela é auxiliada por diversas proteínas e enzimas, que jutas formam o que chamamos de maquinaria de transcrição gênica. Dentre as enzimas encontradas nessa maquinaria destacamos a helicase, que abre a dupla fita de DNA expondo as bases nitrogenadas que servirão de molde para a síntese de mRNA. Ela atua rompendo as pontes de hidrogênio entre as bases das duas fitas de DNA. Entretanto, essa dupla fita pode voltar a formar pontes de hidrogênio assim que a helicase passar, como se fosse um zíper, o que é evitado com a ligação de diversos fatores a essas regiões.

Ao deslizar pelo DNA já aberto, a RNA polimerase (no caso a RNA polimerase II) passa a sintetizar a molécula de RNA mensageiro lendo a fita 3' → 5' e adicionando os nucleotídeos livres na sequência complementar à fita molde. Assim, se encontramos na fita molde a base citosina (C), a RNA polimerase adicionará à cadeia a base guanina (G). Se a próxima base na fita molde for a timina (T), a RNA polimerase adicionará uma adenina (A) à cadeia. Entretanto, se a base encontrada na fita molde for a adenina (A), a RNA polimerase deveria adicionar uma timina (T), fato que não acontece, pois a base timina não é encontrada em nenhum tipo de RNA, sendo substituída, então, pela base nitrogenada uracila (U). Assim, sempre que a RNA polimerase ler a base A, ela adicionará a base U ao mRNA.

Dessa forma a síntese de mRNA desenrola-se ao longo da molécula de DNA, somente parando quando a RNA polimerase encontrar uma sequência de nucleotídeos específica, conhecida como região de terminação. Nesse momento a molécula de mRNA recém-sintetizada é liberada e toda a maquinaria é desmontada. Esse mRNA recém-sintetizado é conhecido como hnRNA (RNA nuclear heterogêneo, sigla em inglês), devido ao seu grande tamanho quando comparado aos maiores RNAs que seriam necessários para produzir as proteínas. Isso ocorre pelo fato de existirem diversas regiões que não são codificantes no mRNA.

Conforme esses mRNA vão sendo sintetizados, suas extremidades vão sofrendo alterações que tem por finalidade proteger essas moléculas, evitando a sua degradação. Para isso, a extremidade 5' da fita recém-sintetizada (é a região que é exposta primeiro pelo fato da polimerase sintetizar somente no sentido 5' → 3') é modificada pela adição de um nucleotídeo G metilado, formando um “quepe”. Esse quepe, além de proteger o mRNA, será de grande importância no momento da tradução desse mRNA. Ao encontrar o sinal de terminação, a RNA polimerase adiciona uma sequência longa de nucleotídeos A, formando uma “cauda poli A”, a qual protege a extremidade 3'.

Temática: Transcrição do DNA  

          

Vimos na aula anterior os passos iniciais da transcrição do DNA em m molécula de mRNA. Essa molécula recém-sintetizada é conhecida como hnRNA (RNA nuclear heterogêneo), pelo fato de ser muito maior do que um mRNA para sintetizar uma proteína.

Os eucariotos, durante a evolução, adotaram uma tática de proteção do genoma que consiste em inserir regiões não codificantes no meio dos genes. Isso assegura à célula que uma mutação causada aleatoriamente não necessariamente atingirá uma região que codifica uma proteína, o que comprometeria todo um organismo. Assim, quando se inserem regiões que não fazem sentido nenhum do ponto de vista informacional, uma mutação que ocorra nessa região não afetará de maneira alguma a célula.

Em procariotos não existe a presença de regiões não codificantes em seu genoma. Inicialmente, o estudo do material genético era realizado em bactérias e, quando se passou a estudar os genomas eucariotos a descoberta dessas regiões foram realmente surpreendentes.

A imagem ao lado mostra as regiões não codificantes em um fragmento de DNA. As regiões em vermelho são conhecidas com íntrons, e não possuem nenhuma importância informacional, sendo removidos do transcrito primário (hnRNA) por um processo conhecido como splicing de RNA. Os íntrons possuem tamanho variando entre apenas   80 nucleotídeos até 10.000 ou mais. Os genes de mamíferos, por exemplo, possuem mais íntrons do que éxons propriamente ditos. Já as regiões entre os íntrons são conhecidas como éxons, e é nelas que a informação para a síntese de proteínas está impressa. 

Embora não representado em detalhes, o splincing do RNA consiste na formação de alças nas regiões intrônicas, as quais serão cortadas e removidas por enzimas especiais, entre elas uma ligase, a qual ligará as duas extremidades criadas após o corte da molécula. Todas as enzimas e fatores necessários para o splicing do mRNA formam um   grande complexo chamado de spliceossomo. O splicing do mRNA deve ser muito   preciso, uma vez que a remoção de uma única base a mais fará com que a leitura do   mRNA no ribossomo seja alterada e, consequentemente, a mensagem se tornará sem   sentido.

Como não existe nenhum impedimento para que uma extremidade 5' do mRNA seja ligada a uma extremidade 3' qualquer do mesmo mRNA, o splicing permite que ocorra uma troca na ordem primária dos éxons, o que aumenta drasticamente a quantidade de proteínas diferentes codificadas por um mesmo gene. Assim, por exemplo, podemos imaginar uma sequência primária de éxons nomeadas aleatoriamente como A – B – C – D – E. Durante o Splicing podem ser formadas qualquer sequência que envolvam esses cinco éxons, como por exemplo C – E – A – D – B ou B – E – C – A – D. Portanto, chegamos a conclusão de que a presença de regiões não codificantes nos genomas eucarióticos adquiridas durante a evolução desempenham duas importantes funções: a) proteger o genoma de mutações que possam ocorrer aleatoriamente em seus genes e, b) produzir uma quantidade de proteínas na célula que são em número muito maiores do que o esperado, quando se leva em conta a quantidade de genes que determinada espécie possui.

Após ter passado pelo processo de splicing, as moléculas de mRNA são reconhecidas por proteínas do poro nuclear e transportadas para o citoplasma. Caso alguma molécula de mRNA marcada para splicing passe diretamente para o citoplasma junto com alguma outra molécula de mRNA já processada, ela é imediatamente levada de volta ao núcleo celular e processada pelo spliceossomo.

Com a chegada do mRNA ao citoplasma será dado início ao processo de tradução gênica.

Temática: Tradução Gênica            

Todos os seres vivos expressam suas características por meio de um código universal, conhecido como Código Genético. Por meio desse código as informações armazenadas no DNA em forma de uma sequência lógica de bases nitrogenadas adquirem forma e função através das proteínas, o produto final da informação genética.

Vimos nas aulas anteriores como a cópia da mensagem genética é realizada pela célula, convertendo essa mensagem a partir da sua forma original, o DNA, para o mRNA. Vimos também que antes de deixar o núcleo celular esse mRNA sofre diversas modificações até se transformar em um mRNA “maduro” e deixar o núcleo por meio do seu reconhecimento por proteínas específicas dos poros nucleares, indo em direção ao citoplasma.

É no citoplasma que a fase de montagem das proteínas, fase essa conhecida como TRADUÇÃO GÊNICA, ocorre, uma vez que lá se encontram os principais personagens que farão esse trabalho, os ribossomos. Os ribossomos podem ser encontrados tanto livres ou em grupos no citoplasma como também podem ser encontrados aderidos à membrana do retículo endoplasmático granular. Embora possuam as mesmas características básicas, eles diferem quanto ao destino final da proteína por eles sintetizada. Quando um mRNA é traduzido por ribossomos encontrados no citoplasma da célula, a proteína tem como destino final a própria célula, ou seja, a proteína desempenhará suas funções no interior da célula. De modo inverso, os mRNAs traduzidos nos ribossomos do retículo endoplasmático granular produzirão proteínas que serão exportadas, ou seja, elas seguirão uma rota biossintética cujo destino final não é a própria célula, podendo ir para diversos locais diferentes, desde o sangue, como ocorre com a insulina (hormônio proteico produzido pelas células beta do pâncreas) até a matriz celular adjacente, como ocorre com o colágeno. 

Embora possuam destinos diferentes, os processos básicos  são os mesmos tanto para os ribossomos encontrados  no citoplasma como para os encontrados no retículo  endoplasmático granular. Entretanto, é bom lembrar que  ribossomos procarióticos são diferentes dos ribossomos  eucarióticos. Eles diferem no tamanho de suas subunidades,  fazendo dos ribossomos procarióticos excelentes alvos para  drogas antibióticas.

Além da presença dos ribossomos, é necessário também a  presença de várias outras moléculas para a tradução gênica,  entre elas o tRNA (RNA transportadores). Os tRNAs são  responsáveis pelo transporte dos aminoácidos até o seu ponto  de montagem, ou seja, no interior dos ribossomos. Sua  estrutura é similar ao próprio mRNA, sendo formado por apenas  uma fita onde as bases nitrogenadas ficam expostas. Entretanto,  diferente dos outros tipos de RNAs, o tRNA assume a conformação de um trevo, como mostrado na imagem. Observe a região em destacada em vermelho. Essa região corresponde ao que chamamos de anticódon. Nela encontramos uma sequência de três bases nitrogenadas que determinam qual o tipo de aminoácido que é transportado por esse tRNA. Como existem quatro tipos de bases nitrogenadas que podem ocupar essa região (A, U, C ou G) teríamos então a possibilidade de formar 4³ combinações diferentes, ou seja, 64 tipos de combinações, cada uma delas indicando um aminoácido.

Entretanto, existem apenas 20 tipos diferentes de aminoácidos encontrados nos seres vivos.   Uma análise mais detalhada, que por sinal levou vários anos, revelou que mais de um tipo de tRNA pode conduzir o mesmo aminoácido. Esse fato nos demonstrou que o código genético é degenerado. Como exemplo podemos citar o aminoácido Leucina, o qual é codificado pelas seguintes trincas de bases nitrogenadas no mRNA (códon): CUU, CUC, CUA, CUG, UUA e UUG. A primeira vista parece uma verdadeira confusão, onde a vida parece ter emergido de sequências não tão bem definidas. Entretanto, ao olharmos para os fatos com maior acuidade, veremos que essa degeneração do código genético é mais uma forma de proteção da informação genética. Se por um lado temos diversos mecanismos que evitam, ou dificultam, as mutações, que nem sempre podem funcionar devido ao enorme tamanho do DNA e assim aumenta a probabilidade delas ocorrerem, por outro temos uma rota de escapatória caso uma mutação ocorra. Assim, supondo que a informação genética que definiria a presença dos aminoácidos Leucina inicialmente pela sequência CUU tenha sofrido uma mutação ao acaso, passando a CUC, o aminoácido codificado ainda será o mesmo, e a proteína não sofrerá nenhuma alteração. Podemos ainda prever duas mutações na mesma trinca indicada acima, passando ela de CUC para UUA (note que o primeiro C foi substituído por um U e o último por um A), e mesmo assim o aminoácido ainda será a Leucina.

Como vimos a sequência de três bases nitrogenadas encontradas no tRNA é chamada de anticódon. Isso ocorre pela fato de haver um pareamento entre as bases do tRNA e do mRNA durante a tradução da informação genética. A sequência de bases encontrada no mRNA é conhecida como códon, e é por meio dessa trinca de bases que os aminoácidos são ordenados de acordo com a informação genética. Da mesma forma como ocorre no DNA, as bases do tRNA e do mRNA formam pares. Por exemplo, se a sequência de bases do códon for AUG, o tRNA que possuir o anticódon UAC pareará com ele.

Como já mencionado anteriormente, a tradução gênica ocorre dentro dos ribossomos. Conhecer sua estrutura é fundamental para compreender o processo de tradução que nele ocorre. Os ribossomos são formados por duas subunidades, conhecidas como subunidade maior e subunidade menor. A imagem A mostra a subunidade menor, e a imagem B mostra a subunidade maior, ambas vistas de lado e frontalmente. Nelas encontramos as regiões: 1) cabeça; 2) plataforma; 3) base; 4) cume; 5) protuberância central; 6) parte de trás; 7) talo e 8) parte da frente.

Essas subunidades se unem, formando o ribossoma, como mostrado na sequência, onde 1 representa a subunidade maior e 2 a subunidade menor. A subunidade maior apresenta três regiões distintas para a ligação dos tRNAs. Elas são conhecidas como região A, região P e região E, sendo que a região E é responsável pela ligação da molécula de mRNA e as outras duas pela ligação dos tRNAs.

O ribossomo é montado em cima de uma molécula de mRNA, fazendo com que dessa forma o mRNA fique no interior dele. A síntese de proteína ocorre pelo deslizamento do ribossomo ao longo da cadeia de mRNA. A primeira etapa da síntese consiste na ligação de uma molécula de aminoacil-tRNA ao sítio A, que está desocupado (ao lado do sítio P, já ocupado pelo aminoácido metionina, pois a sequência de iniciação é AUG), fazendo o pareamento das bases expostas no sítio A. A seguir, a extremidade carboxil do polipeptídeo em crescimento se separa da molécula de tRNA no sítio P e se liga por meio de uma ligação peptídica a uma molécula de tRNA localizada no sítio A. Após a formação da ligação peptídica, o novo peptidil-tRNA recém-formado e localizado ainda no sítio A é translocado para o sítio P e o ribossomo desliza na direção contrária, exatamente três nucleotídeos no mRNA. Assim, ele lê quais são esses três novos nucleotídeos expostos e promove o acoplamento de um tRNA que possua o anticódon correto para aquele códon exposto. Esse passo da reação é energeticamente desfavorável e, assim, está acoplada a hidrólise do GTP. A seguir, o processo de formação de uma ligação peptídica ocorre novamente, bem como o deslocamento do ribossoma pelo mRNA. Dessa forma, o mRNA vai tendo seus códons expostos e o pareamento com o anticódon localizado no tRNA específico vai ocorrendo.

No momento em que o ribossomo encontrar um dos códons UAA, UAG ou UGA ele não encontra nenhum tRNA com um anticódon correspondente. Essas sequências são conhecidas como códons de terminação e indicam o final da cadeia polipeptídica. Ao encontrar essa sequência, o complexo de tradução é desmontado e o polipeptídeo é liberado.

Como todos os processos naturais, a síntese de proteínas busca gastar o mínimo de energia possível. Assim, para expressar um determinado gene cujo produto deve ocorrer em grandes concentrações, como a melanina na pele, a célula não precisa necessariamente transcrever o mesmo gene milhares de vezes, produzindo um mRNA para cada proteína. O mRNA pode estar ligado a vários ribossomos, um na sequência do outro, formando o que chamamos de polirribossomos. Assim, conforme o primeiro ribossomo vai deslizando sobre o mRNA, ele vai deixando parte dele para trás e continua assim até o final. Outros ribossomos vão se ligando à região do mRNA já traduzida, iniciando, assim, a síntese do mesmo polipeptídeo sem a necessidade de um novo mRNA.

Agora nos surge a questão do que aconteceria com a cadeia polipeptídica se houvesse uma mutação no DNA que alterasse algum, ou alguns, nucleotídeos. Já demonstramos anteriormente que uma mutação não obrigatoriamente conduz à alterações no polipeptídeo final. Entretanto, algumas mutações passam desapercebidas pela célula e provocam alterações no produto final do gene. Essa é a base para a compreensão dos mecanismos do câncer, tema que será abordado em mais detalhes nas aulas 31 e 32. Vamos supor uma mutação que altere a sequência de iniciação da tradução de AUG para AUA. O códon AUG determinava o aminoácido metionina, que é a sequência de reconhecimento da maquinaria de tradução. Ao sofrer uma mutação desse tipo o gene acaba por ser inativado irreversivelmente, uma vez que a maquinaria vai procurar essa mesma sequência e não a encontrará, e assim, não sintetizará o polipeptídeo, mesmo embora ele tenha sido transcrito do DNA. Essa transcrição ocorreu mesmo com o gene mutado porque o controle da transcrição é efetuado pelo promotor, que está distante do gene em questão.

Vamos supor agora que uma mutação alterou um códon que não seja nem o códon de iniciação nem o códon de terminação. A alteração do códon UUU por UUG levou à troca do aminoácido fenilalanina por um aminoácido valina. Essa alteração provocará mudanças na conformação espacial (estrutura terciária) da proteína, podendo fazer com que ela perca completamente sua função. Como cada aminoácido difere um do outro apenas pela sua cadeia lateral, cadeias laterais com propriedades parecidas podem não fazer tanta diferença quando trocados, ao passo que cadeia laterais com propriedades completamente diferentes induzem alterações drásticas nas proteínas mutantes.

Temática: Alterações Pós-Traducionais            

Vimos anteriormente os mecanismos básicos de síntese de proteínas, desde a transcrição do gene em mRNA até a sua tradução na cadeia polipeptídicas. Em seguida estudamos como as proteínas desempenham suas funções na célula, partindo do princípio que sua estrutura determina sua função. Hoje completaremos o estudo da tradução gênica considerando as alterações que ocorrem nas proteínas após sua tradução pelos ribossomos.

Nenhum ser vivo trabalha com processos 100% fiéis. Sempre ocorrem erros, mas durante a evolução, mecanismos que permitiam diminuir a frequência desses erros foram selecionados de forma benéfica. Em relação à síntese de proteínas, a taxa de erro é de apenas 1 aminoácido incorporado incorretamente para cada 10⁴(10.000) aminoácidos incorporados de maneira correta. Assim, espera-se que para cada 25 proteínas com um tamanho médio de 400 aminoácidos em sua cadeia polipeptídica exista uma proteína com um erro.

Após a proteína ser completamente sintetizada ela ainda sofre diversas modificações. Essas modificações incluem a adição de grupamentos químicos com características específicas, os quais passam alteram as propriedades finais das proteínas. Essas alterações podem ser a simples adição de um grupo fosfato que, nesse caso, é uma reação conhecida como fosforilação. Pode ocorrer também a adição de um grupo metil (metilação). Enfim, uma infinidade de alterações pós-traducionais podem ocorrer, todas elas fornecendo características específicas à proteína.

Essas alterações além de configurar uma nova propriedade às proteínas servem também como processos regulatórios. Para se ter uma ideia, cerca de 10% das proteínas presentes em uma célula de mamífero estão fosforiladas, embora pesquisas mais recentes apontem para cerca de 30%. Isso reflete a importância desses mecanismos de controle de atividade das proteínas.

A fosforilação de proteínas atua de forma a “ligar” e “desligar” as proteínas. A fosforilação é uma reação catalizadas por enzimas especiais chamadas proteínas quinases e a desfosforilação é catalizadas por enzimas denominadas fosfatases. Geralmente a fosforilação ocorre em múltiplos sítios da proteína. A imagem ao lado representa o aminoácido serina fosforilado e logo abaixo se encontra o grupamento fosfato inorgânico, o qual foi adicionado ao aminoácido serina. Obviamente que se uma proteína é fosforilada isso ocorrerá em seus constituintes, os aminoácidos.

Com o aprimoramento das técnicas de estudos moleculares desenvolveram-se anticorpos específicos para detectar proteínas em estado fosforilado. Esses anticorpos são denominados anticorpos fosfo-específicos e podem identificar um grupo fosfato em qualquer sítio de ligação dele com a proteína. Hoje existem centenas desses anticorpos disponíveis para pesquisa, sendo muito utilizados não somente em pesquisas, mas também em diagnósticos clínicos.

O aminoácido mais comumente fosforilado é a serina, a qual está representada na imagem acima. Em segundo lugar aparece o aminoácido treonina. Já em relação à tirosina, ela raramente aparece fosforilada nas células. Em procariotos a fosforilação dos aminoácidos histidina e aspartato são frequentes, fazendo deles partes de dois componentes de sinalização celular.

Outra tipo importante de quinase são as proteínas quinases tirosina específicas. Elas são receptores transmembrana com o seu domínio quinase voltado para o citoplasma, sendo responsáveis pela transdução de sinais. Elas estão relacionadas a importantes eventos celulares como, por exemplo, regulação da divisão e proliferação celular e morfogênese.