Ultracentrifugação

A análise bioquímica requer amostras altamente purificadas e em quantidades que sejam suficientes para o estudo. Assim, obter amostras livres de contaminantes (entenda-se aqui como contaminante qualquer molécula que não a de interesse do estudo) tornou-se um dos principais alvos da bioquímica moderna. Amostras não puras podem levar o pesquisador a erros pela reação dos que reagem com outras moléculas ou pela própria ligação dos reagentes com o objeto de estudo. Dessa forma, o desenvolvimento de métodos de purificação determinou um grande avanço na bioquímica durante o século passado.

As organelas celulares podem ser isoladas a partir de uma amostra pelo processo de centrifugação. A centrifugação e, mais atualmente, a ultracentrifugação, consistem em aplicar uma força centrífuga, a qual é conseguida pela rotação da amostra sobre um eixo central fixo. A equação abaixo descreve a força centrífuga atuando sob um corpo de massa m:

Assim, a força centrífuga é diretamente proporcional à massa do corpo e a sua velocidade e, inversamente proporcional ao raio da sua trajetória. Em outras palavras, quanto maior a massa e/ou a velocidade de rotação maior será a força aplicada. Ao contrário, quanto maior o raio da trajetória menor será a força aplicada.

A imagem a seguir mostra uma centrífuga de mesa utilizada em laboratórios.

 Assim, há um gradiente de deposição das amostras, em que os elementos mais densos encontram-se no fundo do frasco e os menos densos se encontram na região superficial da amostra. Entre a região superficial e o fundo encontram-se os elementos intermediários. A centrifugação das amostras é capaz de separar as organelas existentes no citosol.

 A centrifugação é utilizada para separar a fase aquosa de uma amostra da sua fase sólida. A fase sólida se deposita no fundo e a fase aquosa fica na região superior, formando um sobrenadante, o qual pode ser aspirado e separado da amostra inicial. Esse é o princípio utilizado na centrifugação do sangue, cujo sobrenadante é representado pelo plasma sanguíneo e o sedimento é representado pelas células sanguíneas (eritrócitos, leucócitos e plaquetas).

Nos anos 1960, foi desenvolvida uma técnica chamada centrifugação diferencial, a qual consiste em aplicar em uma amostra homogênea, por exemplo, de um tecido humano centrifugações de forma repetitiva, sendo que a cada centrifugação aumenta-se a força aplicada pelo aumento da velocidade. Essa foi a técnica que permitiu a separação das organelas das células eucariontes, embora venha sendo substituída por uma técnica mais moderna, a centrifugação isopícnica.

A centrifugação isopícnica, também chamada de centrifugação de equilíbrio, consiste no uso de gradientes de uma solução base para realizar a separação das partículas. Vamos tomar como exemplo a separação de amostras de DNA de mesmo tamanho, mas que diferem na sua relação AT/CG. Nesse processo, usamos Cloreto de Césio (CsCl), numa concentração que torna sua densidade bem próxima ao do DNA, misturado à amostra de DNA que se deseja separar. Essa mistura é centrifugada a cerca de 10.000 g por dois ou três dias. Após esse período de centrifugação, será formado um gradiente de CsCl, o qual separa o DNA de acordo com sua proporção AT/CG ao longo do tubo.

Outra variante da centrifugação isopícnica consiste no uso de soluções de sacarose de diferentes concentrações para a separação de organelas celulares, como dito anteriormente. Inicialmente, coloca-se no tubo a solução mais concentrada e, em seguida, as soluções em ordem decrescente de concentração, criando-se assim um gradiente de densidade no interior do tubo onde a amostra será colocada. Assim, ao aplicar a força centrífuga, as organelas migram em direção ao fundo do tubo e ficam paradas no local onde a sua densidade é igual à densidade da sacarose. As amostras são em seguida aspiradas cuidadosamente, isolando-se, assim, as diferentes organelas e moléculas.

Embora se obtenham amostras altamente purificadas, é importante ter em mente que os resultados obtidos com essas amostras isoladas não correspondem à realidade do que ocorre no organismo vivo. Assim, definimos esse estudo como in vitro e em seres vivos de in vivo. Trabalhar com amostras altamente purificadas impede que outras estruturas se liguem e interajam com o seu objeto de estudo, o que não ocorre in vivo, uma vez que já foi explicado que os processos encontrados na natureza são altamente dinâmicos. Assim, um processo que foi descrito in vitro deve ser também bem estudado in vivo.