Sugestão de Atividade Prática com Enzimas

Aula prática

Introdução:

Atividade prática para alunos do 9º ano do Ensino Fundamental.

A atividade proposta é sobre a ação de enzimas presentes na saliva (Amilase Salivar) sobre o amido.

O amido é um polissacarídeo de reserva energética dos vegetais, produzido pelo processo da fotossíntese e acumulado geralmente em órgãos como sementes, raízes tuberosas, tubérculos e frutos sob a forma de grãos (Figura 1).

Figura 1 – Grãos de amido presentes no interior das células dos tecidos de armazenamento da batata. Extraído de sanabria.j.googlepages.com/starch.jpg/starch-... Consulta em 14/10/09.

Quando um indivíduo ingere um alimento a base de amido, como uma batata, por exemplo, o processo de digestão dessa substância inicia-se na boca. Outros alimentos que não possuem amido em sua composição, são apenas triturados na boca, sendo posteriormente digeridos no estômago e no intestino delgado.

É relativamente fácil conhecer os alimentos que possuem amido em sua composição, desde que se saiba a origem botânica de tais alimentos. Por exemplo: a tapioca é feita a partir da mandioca, que é uma raiz tuberosa. Portanto, na tapioca certamente haverá amido.

No entanto, para determinarmos com certeza a presença de amido nos alimentos é importante utilizar uma solução indicadora, que pode ser uma solução de iodo ou lugol. O iodo é um importante indicador da presença de amido através da mudança de cor. Alimentos que possuem amido em sua composição geralmente ficam com uma tonalidade azulada, arroxeada ou quase negra quando colocamos algumas gotas de solução de iodo ou lugol sobre eles (Figura 2).

Figura 2 – Grãos de amido presentes em um caule (corte transversal). Verificar coloração arroxeada devido ao lugol. Extraída de lh5.ggpht.com/.../WUUt--6q5RU/CIMG1629.JPG. Consulta em 14/10/09.

Materiais necessários ao experimento:

Água

1 vidro conta gotas com lugol

1 copinho plástico ou pequeno Becker

Tubos de ensaio

Uma estante para tubos de ensaio

Uma espátula

Procedimentos:

1º Coloque água no Becker e acrescente duas espátulas de solução de amido (por exemplo, amido de milho em pó). Misture bem.

2º Numere os tubos de ensaio (1 e 2) e coloque-os na estante.

3º Coloque em cada tubo 4 espátulas da mistura de amido + água.

4º Acrescente 3 espátulas de saliva no tubo 2 e agite.

5º Espere 30 minutos e pingue uma gota de lugol em cada tubo.

6º Analise os resultados.

Ultracentrifugação

A análise bioquímica requer amostras altamente purificadas e em quantidades que sejam suficientes para o estudo. Assim, obter amostras livres de contaminantes (entenda-se aqui como contaminante qualquer molécula que não a de interesse do estudo) tornou-se um dos principais alvos da bioquímica moderna. Amostras não puras podem levar o pesquisador a erros pela reação dos que reagem com outras moléculas ou pela própria ligação dos reagentes com o objeto de estudo. Dessa forma, o desenvolvimento de métodos de purificação determinou um grande avanço na bioquímica durante o século passado.

As organelas celulares podem ser isoladas a partir de uma amostra pelo processo de centrifugação. A centrifugação e, mais atualmente, a ultracentrifugação, consistem em aplicar uma força centrífuga, a qual é conseguida pela rotação da amostra sobre um eixo central fixo. A equação abaixo descreve a força centrífuga atuando sob um corpo de massa m:

Assim, a força centrífuga é diretamente proporcional à massa do corpo e a sua velocidade e, inversamente proporcional ao raio da sua trajetória. Em outras palavras, quanto maior a massa e/ou a velocidade de rotação maior será a força aplicada. Ao contrário, quanto maior o raio da trajetória menor será a força aplicada.

A imagem a seguir mostra uma centrífuga de mesa utilizada em laboratórios.

 Assim, há um gradiente de deposição das amostras, em que os elementos mais densos encontram-se no fundo do frasco e os menos densos se encontram na região superficial da amostra. Entre a região superficial e o fundo encontram-se os elementos intermediários. A centrifugação das amostras é capaz de separar as organelas existentes no citosol.

 A centrifugação é utilizada para separar a fase aquosa de uma amostra da sua fase sólida. A fase sólida se deposita no fundo e a fase aquosa fica na região superior, formando um sobrenadante, o qual pode ser aspirado e separado da amostra inicial. Esse é o princípio utilizado na centrifugação do sangue, cujo sobrenadante é representado pelo plasma sanguíneo e o sedimento é representado pelas células sanguíneas (eritrócitos, leucócitos e plaquetas).

Nos anos 1960, foi desenvolvida uma técnica chamada centrifugação diferencial, a qual consiste em aplicar em uma amostra homogênea, por exemplo, de um tecido humano centrifugações de forma repetitiva, sendo que a cada centrifugação aumenta-se a força aplicada pelo aumento da velocidade. Essa foi a técnica que permitiu a separação das organelas das células eucariontes, embora venha sendo substituída por uma técnica mais moderna, a centrifugação isopícnica.

A centrifugação isopícnica, também chamada de centrifugação de equilíbrio, consiste no uso de gradientes de uma solução base para realizar a separação das partículas. Vamos tomar como exemplo a separação de amostras de DNA de mesmo tamanho, mas que diferem na sua relação AT/CG. Nesse processo, usamos Cloreto de Césio (CsCl), numa concentração que torna sua densidade bem próxima ao do DNA, misturado à amostra de DNA que se deseja separar. Essa mistura é centrifugada a cerca de 10.000 g por dois ou três dias. Após esse período de centrifugação, será formado um gradiente de CsCl, o qual separa o DNA de acordo com sua proporção AT/CG ao longo do tubo.

Outra variante da centrifugação isopícnica consiste no uso de soluções de sacarose de diferentes concentrações para a separação de organelas celulares, como dito anteriormente. Inicialmente, coloca-se no tubo a solução mais concentrada e, em seguida, as soluções em ordem decrescente de concentração, criando-se assim um gradiente de densidade no interior do tubo onde a amostra será colocada. Assim, ao aplicar a força centrífuga, as organelas migram em direção ao fundo do tubo e ficam paradas no local onde a sua densidade é igual à densidade da sacarose. As amostras são em seguida aspiradas cuidadosamente, isolando-se, assim, as diferentes organelas e moléculas.

Embora se obtenham amostras altamente purificadas, é importante ter em mente que os resultados obtidos com essas amostras isoladas não correspondem à realidade do que ocorre no organismo vivo. Assim, definimos esse estudo como in vitro e em seres vivos de in vivo. Trabalhar com amostras altamente purificadas impede que outras estruturas se liguem e interajam com o seu objeto de estudo, o que não ocorre in vivo, uma vez que já foi explicado que os processos encontrados na natureza são altamente dinâmicos. Assim, um processo que foi descrito in vitro deve ser também bem estudado in vivo.

Compostos Orgânicos

ORIGEM DOS COMPOSTOS ORGÂNICOS

Se pudéssemos voltar cerca de 3,5 bilhões de anos, encontraríamos um planeta Terra muito diferente do que conseguimos ver nesse momento. As condições terrestres nos primeiros 700 milhões de anos após a sua formação impedia a existência de qualquer tipo de vida. Durante milhões de anos a Terra resfriou-se, transformando-se lentamente. A atmosfera primitiva provavelmente continha apenas os gases CH₄ (metano), NH₃ (amônia), H₂ (hidrogênio) e H₂O_(g) (água). Esses gases, quando misturados em laboratório e expostos à radiação ultravioleta e/ou descargas elétricas, podem formar moléculas orgânicas simples, como alguns aminoácidos e nucleotídeos, os precursores das proteínas e ácidos nucleicos, respectivamente. Esse experimento foi conduzido pela primeira vez por Stanley Lloyd Miller (n. 1930), um então eminente estudante de química. Miller tentou simular em seu experimento as condições existentes na Terra primitiva. As descargas elétricas simulavam os raios que atingiam a superfície terrestre a todo momento, decorrentes de chuvas torrenciais que duraram milhares de anos. A radiação ultravioleta simulava essa radiação originada no Sol, uma vez que ainda não existia a camada de ozônio (O₃) para filtrar esses feixes.

A partir dessas premissas, a evolução química ganhou destaque no meio científico. Por meio dela, a vida teve origem na Terra. Entretanto, estudos atuais têm demonstrado que microrganismos poderiam ter chegado à Terra se estivessem inseridos no interior dos meteoritos, local onde a temperatura não é muito elevada quando comparada à superfície do mesmo, quando este entra na atmosfera terrestre. Assim, uma das grandes vertentes sobre a origem da vida na Terra é a Panspermia, a qual propõe que a vida na Terra pode ter tido uma origem extraterrestre. Verdadeira ou não, a Panspermia não resolve o problema da origem da vida, sendo que ela apenas leva o problema para outro local, no qual a vida deve ter se originado. De qualquer forma, as primeiras formas de vida eram extremamente simples. Os chamados coacervados foram as primeiras estruturas orgânicas capazes de se autorreplicar, e por isso são considerados os primeiros seres vivos. Tais seres eram compostos por aglomerados de moléculas orgânicas simples envoltos em moléculas de água. A partir dessas primeiras moléculas foram surgindo outras mais complexas, diferentes em funções e estrutura.

Durante esse semestre, além da disciplina de Biologia Molecular, você estudará a disciplina de Bioquímica, a qual lhe fornecerá dados mais detalhados sobre a estrutura e composição das moléculas que formam os seres vivos. De forma geral podemos representar as moléculas constituintes dos seres vivos classificando-as em dois grupos: moléculas inorgânicas e moléculas orgânicas. Nessa e na próxima aula caracterizaremos de forma geral essas moléculas, dando ênfase às macromoléculas que são de importância fundamental à Biologia Molecular: os ácidos nucleicos e as proteínas.

COMPOSTOS INORGÂNICOS

Os compostos inorgânicos que formas as células são a água e os sais minerais. A água perfaz cerca de aproximadamente 70% do corpo humano de um indivíduo adulto, embora essa proporção varie de acordo com a idade e com o estado fisiológico do indivíduo. Sua principal característica é ser um dipolo, o que lhe permite dissolver quase todas as substâncias.

Note na imagem ao lado, que do lado da molécula onde se encontram os átomos de hidrogênio existe uma maior distribuição de cargas positivas, ao passo que do lado da molécula onde se encontra o átomo de oxigênio há uma maior quantidade de cargas negativas. Essa distribuição permite às moléculas de água criar pontes de hidrogênio entre elas, o que é refletido na sua tensão superficial, como mostra a imagem abaixo, na qual uma moeda é capaz de flutuar sobre a água. Isso também é visto quando insetos literalmente “pousam” na água sem afundar. 

Como a distribuição eletrônica na molécula de água não é homogênea se forma então dois polos na molécula. Assim, chamamos essas estruturas de moléculas polares. Por outro lado existem moléculas que possuem sua distribuição eletrônica homogênea e, por esse motivo, são chamadas de apolares (sem polos). Uma regra química básica explica o comportamento das moléculas em termos de dissolução: “semelhante dissolve semelhante”. Assim, moléculas apolares só poderão ser dissolvidas em moléculas apolares e moléculas polares só serão dissolvidas em moléculas polares.

Outro fator físico importante para a molécula de água é a sua grande capacidade de absorver calor sem variar muito sua temperatura. Isso é representado pelo seu alto calor específico e, assim, a água atua como um ótimo regulador térmico.

SAIS MINERAIS

Os sais minerais possuem as mais diversas funções no organismo, desde ser um fator-chave na contração muscular como no caso do Ca⁺⁺ (cálcio) até servir como reguladores eletrolíticos, bem como atuar na formação de estruturas carreadoras, como no caso da hemoglobina, molécula encontrada no sangue que possui ferro em sua composição, sendo responsável pelo transporte de oxigênio até as células. Os íons fosfato estão relacionados com a formação de ATP na célula, principal fonte de energia química para a mesma. Na molécula de ATP, os íons fosfatos inorgânicos (Pi) são ligados uns aos outros. Essas ligações, quando rompidas, liberam grande quantidade de energia para as reações celulares.

COMPOSTOS ORGÂNICOS

Glicídeos

Os glicídeos, também conhecidos como carboidratos ou hidratos de carbono são moléculas altamente energéticas. Sua principal função é como alimento, sendo que a queima de 1g de carboidrato libera cerca de aproximadamente 4 kcal. O carboidrato mais conhecido é a glicose (C₆H₁₂O₆), a qual é o principal alimento responsável pela geração de ATP nos animais. De acordo com o número de moléculas encontradas unidas por ligações glicosídicas, podemos classificar os carboidratos em monossacarídeos (1 molécula de açúcar, glicose por exemplo), dissacarídeos (duas moléculas de açúcar, sacarose por exemplo), polissacarídeos (3 ou + moléculas de açúcares, como a quitina, por exemplo).

Dentre os principais polissacarídeos podemos citar os polissacarídeos

estruturais quitina (imagem ao lado) e celulose e os polissacarídeos de reserva energética, como o glicogênio e o amido. A quitina é responsável pela formação do exoesqueleto dos artrópodes (formigas, gafanhotos, baratas, etc.) enquanto a celulose é responsável pela formação da parede celular das células vegetais. O glicogênio é encontrado em animais e fungos, ao passo que o amido é somente encontrado em vegetais, havendo também diferenças em seus níveis de ramificações da molécula.

LIPÍDEOS

Os lipídeos caracterizam-se pela sua insolubilidade em água, diluindo-se apenas em solventes orgânicos, como éter, por exemplo. Os lipídeos desempenham diversos papéis dentro e fora da célula. Por serem insolúveis e altamente energéticos (1g de lipídeos libera aproximadamente 9,0 kcal), os lipídeos são utilizados como fonte energética, os quais ficam armazenados principalmente no tecido adiposo, mas podem também ser encontrados no fígado.

Além dessa função, os lipídeos formam todas as membranas celulares, sendo que o principal tipo de lipídeo encontrado formando as membranas celulares é o fosfolipídeo, o qual contém um grupo fosfato, que é hidrofílico, formando a “cabeça” do fosfolipídeo. Dessa maneira, dizemos que o fosfolipídeo encontrado nas membranas celulares são anfipáticos, ou seja, são ao mesmo tempo hidrofóbicos (cauda da molécula) e hidrofílicos (cabeça da molécula). Esses fosfolipídeos se organizam na membrana celular de tal forma que as cabeças hidrofílicas ficam voltadas para a região onde há a presença de água, ou seja, para a face citoplasmática e extracelular.

A região interna não contém água, uma vez que aí se encontram as caudas   hidrofóbicas das moléculas. Essas caudas são mantidas estáveis por meio de interações hidrofóbicas.

As ceras, um tipo especial de lipídeo, são encontradas revestindo as folhas dos vegetais

.Essa cera atua como um agente impermeabilizante, sendo que o mesmo evento também é encontrado em aves. As aves possuem uma glândula localizada próxima à cauda, chamada glândula uropigial (ou uropigeana), ilustrada na imagem ao lado. Essa glândula é responsável pela síntese de um óleo que é espalhado pelas penas, impermeabilizando-as, o que é essencial ao voo.

O colesterol é um derivado dos lipídeos. Ele é encontrado na membrana celular apenas de células animais. 

VITAMINAS

As vitaminas são micronutrientes produzidos por outros seres vivos e que são essenciais à função de determinadas enzimas, servindo como cofatores. Algumas vitaminas são muito importantes em algumas reações, como nas físico-químicas que ocorrem na retina no processo da visão. As vitaminas não se enquadram em um único tipo de molécula, sendo que elas podem ser derivadas de lipídeos, glicídeos ou mesmo ter uma estrutura bem simples quando comparada à outras biomoléculas. O termo vitamina foi criado ao se descobrir uma substância chamada tiamina, pertencentes ao grupo das aminas, quando usando em pequenas quantidades, era capaz de evitar uma doença chamada beribéri. Assim, o termo vitamina significa, literalmente, amina vital.

Para exemplificar vamos tomar como exemplo a vitamina A, cujo nome científico é retinol (imagem ao lado).  O seu isômero 11-cis-retinol é o cromóforo da rodopsina, a molécula fotorreceptoras dos vertebrados.

Durante as grandes navegações impetradas pelos europeus durante os séculos XIV, XV e XVI, notou-se que grande parte da tripulação padecia de alguma doença que provocava sangramentos, principalmente nas gengivas. Esses sangramentos eram evitados quando se passou a levar lima nas embarcações. Como se sabe, a lima é um fruto rico em vitamina C (ácido ascórbico), essencial à formação de colágeno. Quados os tripulantes passavam muito tempo sem nenhum alimento que contivesse vitamina C em sua composição, o colágeno que deveria ser reposto não era formado. Assim, a gengiva, mucosa rica em colágeno, começa a sofrer uma queda, expondo vasos sanguíneos que estouravam, provocando os sangramentos.

Muito embora a sabedoria popular afirme que a vitamina C evita gripes e resfriados, essa não é uma afirmação válida. Hoje sabemos, com base em dados científicos, que gripes e resfriados nada tem nenhuma relação com a falta de vitamina C.

ÁCIDOS NUCLÉICOS

Dentre todas grandes descobertas, a caracterização do DNA como molécula responsável pelo armazenamento da informação genética, bem como o desvendamento da sua estrutura, assumem papel de destaque. Todos os organismos vivos, incluindo os vírus, armazenam sua informação genética em um tipo de ácido nucleico, o DNA. Entretanto, alguns vírus adotaram como tática, armazenar sua informação genética em moléculas de RNA, as quais são muito mais vulneráveis à mutações. Assim, o vírus que armazenam a sua informação genética em moléculas de RNA são chamados de retrovírus, enquanto os vírus que a armazenam em moléculas de DNA são chamados de adenovírus.

Inicialmente se suspeitava que o material genético dos seres vivos eram as proteínas, devido à sua grande diversidade. Quando os bioquímicos analisavam as moléculas de DNA observava-se uma grande monotonia de moléculas. O DNA consiste de uma repetição de quatro nucleotídeos que diferem entre si apenas pela sua base nitrogenada. Assim, ficava cada vez mais lógico que o DNA, devido a sua simplicidade, não deveria conter a informação genética. Foi quando se descobriu que os cromossomos eram as estruturas responsáveis por carregar as informações genéticas. Logo em seguida, descobriu-se que os cromossomos são constituídos tanto por 50% proteínas e 50% DNA. Experimentos posteriores confirmaram o DNA como responsável pelo armazenamento da informação genética e, mais tarde, com a estrutura do DNA desvendada, pode-se perceber como essas informações são armazenadas.

O DNA (ácido desoxirribonucleico) é um polímero de nucleotídeos, os quais são compostos por um grupo fosfato, um açúcar de 5 carbonos, no caso a desoxirribose, e uma base nitrogenada, podendo ser qualquer uma entre adenina, timina, citosina e guanina. Cada nucleotídeo é unido ao outro por meio de uma ligação fosfodiéster entre o carbono número 5' de um com o carbono número 3' do nucleotídeo adjacente.

Em relação ao RNA (ácido ribonucleico), este se diferencia do DNA por apresentar a ribose como açúcar, ser uma molécula fita simples e não possuir a base nitrogenada timina em sua composição, a qual é substituída por uracila. Além disso, as funções assumidas pelo RNA são também diferentes das do DNA. Enquanto o DNA é uma molécula imóvel localizada dentro do núcleo celular (em eucariotos), o RNA é uma molécula que leva a informação do núcleo ao citoplasma, onde se encontram os ribossomos, onde ocorrerá a síntese proteica (mRNA). Além de assumir um papel de “bilhete de informações”, o RNA também é responsável por formar os ribossomas (rRNA) e atuar como carregadores de aminoácidos (tRNA).

PROTEÍNAS

As proteínas são polímeros de aminoácidos. Elas divergem muito em tamanho, forma e estrutura. As proteínas são produzidas de acordo com as informações genéticas presente no DNA. Assim, a sequência de nucleotídeos encontrado em um determinado segmento de DNA (gene) ditará a sequência específica de aminoácidos encontrados nas proteínas.

Assim podemos afirmar com convicção que as proteínas são o meio pelo qual os genes se expressam. Por exemplo, o gene que determina a cor da pele é a melanina. Quanto mais melanina estiver presente nas células chamadas melanócitos, mais escura será a cor da pele. Isso pode ser determinado geneticamente ou por uma exposição prolongada ao Sol. A melanina tem como principal função formar um capuz sobre o núcleo celular, como se fosse um guarda-chuva, filtrando os raios ultravioletas produzidos pelo Sol e que causam mutação no DNA.

Assim, exitem milhares de proteínas numa célula humana, cada uma desempenhando o seu papel. Existe um grupo de proteínas que são expressas em todos os tipos celulares, desde um neurônio ao osteócito (célula óssea madura), a quais são responsáveis pelas funções primordiais das células e por isso recebem o nome de proteínas keephouse, ou seja, proteínas que literalmente mantém a casa.