Durante as últimas aulas observamos as grandes inovações no campo da
genética molecular que culminaram com aplicações práticas como, por exemplo, a
clonagem molecular. Na aula de hoje vamos conhecer algumas das técnicas
mais usadas em laboratórios de genética e biologia molecular.
Eletroforese
Vimos que amostras de DNA podem ser clivadas (cortadas) em sítios
específicos por endonucleases de restrição. Entretanto, ao se fazer isso em um
tubo de ensaio obteremos uma amostra cujos fragmentos estão totalmente
misturados. Para separá-los, utiliza-se a mesma técnica usada para separar
proteínas, a eletroforese. O termo eletroforese deriva do grego phoresis, que
significa migração, ação de transportar.
Existem diversas maneiras de se fazer uma separação de amostras pela
técnica da eletroforese, sendo que as diferenças residem no tipo de material
poroso que será utilizado para realizar a separação das amostras. Se sua
amostra contiver fragmentos de DNA muito pequenos, com até 500 nucleotídeos de
comprimento, utilizam-se géis de poliacrilamida, os quais permitem a separação
de fragmentos com uma diferença de apenas 1 nucleotídeo de extensão.
Entretanto, amostras muito grandes não conseguirão passar pelos poros do gel de
poliacrilamida sendo, nesses casos, usados géis mais porosos, constituídos por
soluções de agarose, um polissacarídeo encontrado em algas marinhas.
A técnica de eletroforese consiste em se aplicar uma diferença de
potencial (ddp) entre as duas extremidades do gel onde estão as amostras.
Como o DNA possui carga negativa, aplicam-se as amostras de DNA,
previamente digeridas por endonucleases de restrição, na extremidade onde se
encontra o eletrodo negativo. Assim, as moléculas de DNA migram para pólo
positivo com a passagem da corrente elétrica pelo gel. Os fragmentos menores
atravessam com mais facilidade os poros do gel, chegando antes no lado
positivo. Tudo funciona como se fosse uma corrida com obstáculos. Observe a
imagem acima. Note que o poço C é o que contém o menor fragmento de DNA
produzido pela digestão com uma dada endonuclease de restrição. Já o poço B é o
que contém o maior fragmento, uma vez que nele se encontra a banda mais próxima
ao local de aplicação da amostra.
Essas bandas mostradas acima são invisíveis e devem ser marcadas para
visualização. Essa marcação pode ser feita através do uso de isótopos
radioativos, no caso do DNA utiliza-se 32P, o qual é incorporado as cadeias de
DNA (grupamento fosfato). Assim, após realizar a “corrida” no gel faz-se uma
autorradiografia do mesmo. Outro método usado é expor o gel a uma solução de
brometo de etídeo (C21H2OBrN3). Quando esse marcador é iluminado com luz
ultravioleta ele fluoresce, indicando a posição das bandas no gel.
PCR
A clonagem de sequências de DNA específicas sem o uso de células vivas
tornou-se possível quando se tornaram disponíveis DNA-polimerases altamente
purificadas e oligonucleotídeos de DNA sintetizados em laboratório. Essa
técnica, conhecida como PCR (polimerase chain reaction, reação da cadeia da
polimerase) é utilizada na amplificação do DNA por inteiro ou mesmo para a
amplificação de uma única região de interesse. A PCR baseia-se na estrutura do
DNA, que é formado por uma dupla-hélice estabilizada internamente por pontes de
hidrogênio, as quais se rompem facilmente com a elevação da temperatura até
certo ponto, deixando expostas as bases nitrogenadas. Essa técnica permite a
amplificação em até 1 bilhão de vezes do fragmento que se queira amplificar.
Assim, quando se dispõe de amostras em pequenas quantidades essa técnica
revela-se de extrema importância, como no caso da ciência forense, uma vez que
se pode partir do DNA de apenas uma célula para traçar o perfil genético de um
criminoso, por exemplo.
A imagem abaixo mostra como funciona essa técnica. Tem-se uma amostra de
DNA na qual se encontra uma região de interesse que deve ser amplificada para
posterior análise. Para se realizar essa amplificação, é necessário que se
conheça pelo menos uma parte da sequência de nucleotídeos. Sabendo-se a
sequência de nucleotídeos de uma pequena parte dessa amostra, constrói-se um
primer (iniciador) que seja complementar às extremidades da região de
interesse. Isso é necessário por que a DNA polimerase não é capaz de iniciar a
síntese de DNA do nada.
Com a elevação da temperatura as pontes de hidrogênio são rompidas,
liberando as duas fitas de DNA. Entretanto, esse aumento causa a desnaturação
de proteínas e, sendo a DNA polimerase de uma enzima, ela desnaturaria,
perdendo sua função. Esse problema é resolvido usando-se uma DNA polimerase de
uma bactéria (Thermophilus aquaticus) encontrada em fontes termais. Assim, essa
DNA polimerase, conhecida como Taq polimerase, é estável em altas temperaturas,
o que possibilita o seu uso na PCR.
Ao serem separadas as fitas de DNA, as bases nitrogenadas ficam
expostas, permitindo o anelamento dos primers com suas sequências
complementares. Após isso, a temperatura é reduzida e a DNA polimerase inicia a
síntese de novo DNA a partir dos nucleotídeos livres. Esse ciclo demora cerca
de 5 minutos, ou seja, a cada 5 minutos obtém-se uma quantidade de DNA igual ao
dobro da quantidade anterior.
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