Replicação do DNA

Uma das principais características dos seres vivos é a sua capacidade de se reproduzir. Por meio da reprodução os organismos vivos, sejam eles simples como uma bactéria ou complexos como os mamíferos, mantém seus genes na natureza. Existem dois tipos básicos de reprodução: a reprodução sexuada e a reprodução assexuada. A diferença entre as duas reside no fato de que a reprodução sexuada envolve gametas (células especializadas em reprodução) ao passo que a reprodução assexuada não envolve gametas. Qualquer um desses dois tipos de reprodução envolvem processos de divisão celular, seja para formar os gametas (meiose), seja para se reproduzir por bipartição.

Uma célula humana é composta de 46 cromossomos. Ao se dividir ela origina duas células-filhas com 46 cromossomos cada uma. Se a célula-mãe simplesmente se dividisse, sem nenhuma preparação prévia, o conteúdo de DNA cairia pela metade a cada nova geração. Assim, cada célula-filha conteria 23 cromossomos, as quais, ao se dividirem, dariam origem a duas células-filhas cada uma com 11,5 cromossomos cada. Como isso não pode ocorrer, pois haveria perda de informação genética, as células passam por um processo de duplicação do seu DNA antes de se dividir.

O ciclo de vida de uma célula é chamado de ciclo celular. Nele podemos encontrar duas grandes fases, a primeira chamada intérfase (I) e a segunda chamada mitose (M). A intérfase parece uma fase da vida da célula muito monótona. Entretanto, longe disso, a intérfase é um período em que as células sintetizam suas proteínas, crescem e desempenham suas funções. Já a mitose é a fase de reprodução da célula, na qual ela originará duas células-filhas, idênticas entre si.

A intérfase é dividida em três fases: G₁ (do inglês gap = intervalo), S (de síntese) e G₂ (idem a G₁). É no período G₁ que a célula cresce rapidamente, sintetizando suas proteínas, apresentando, nessa fase, os 46 cromossomos. Quando é disparado um sinal para as células se dividirem, como por exemplo injúria do tecido ou crescimento, a célula entra em fase S, onde duplicará o seu DNA (sintetizar DNA), passando ao final dela a apresentar 92 cromossomos. Esse é o nosso ponto de estudo, a fase S. Terminada a fase S, a célula entra em G₂, um segundo intervalo onde ela verificará se o DNA foi duplicado corretamente e se o ambiente é favorável a sua duplicação. Com todos os pontos de checagem permitindo a sua reprodução, a célula entra em fase M, já discutida em seus pormenores na disciplina de Biologia Celular, não sendo, portanto, necessária sua explicação.

Como vimos, a fase S é uma fase no ciclo celular onde o conteúdo de DNA da célula é duplicado. Como sabemos, o genoma humano possui cerca de 3 bilhões de nucleotídeos, distribuídos de maneira não uniforme pelos seus 23 tipos de cromossomos. O tempo de duração da fase S varia entre os tipos celulares. Por exemplo, as células do duodeno apresentam um ciclo celular de 24 horas. Dessas 24 horas, 8 a 10 horas são gastas somente na fase S, ou seja, entre 8 a 10 horas a célula realiza a cópia de cerca de 3 bilhões de nucleotídeos. Isso significa copiar centenas de volumes de grandes enciclopédias nesse intervalo de tempo, sem cometer nenhum erro de ortografia.

Obviamente que ocorrem alguns erros durante o processo, entretanto a maioria deles são imediatamente corrigidos. Os erros que acabam passando desapercebidos ficam acumulados no DNA, o que representa um dos eventos do processo natural de envelhecimento.

O processo de replicação do DNA é realizado por um complexo enzimático chamado de maquinaria de replicação. A principal enzima desse complexo é a DNA polimerase, responsável pela polimerização (adição de nucleotídeos) do DNA. A exemplo da RNA polimerase, a DNA polimerase somente cataliza a reação na direção 5' → 3'. Essa propriedade traz um pequeno problema para a célula, mas que é contornado sem maiores problemas e será discutido mais adiante.

O primeiro passo do processo de replicação do DNA é abrir a dupla hélice, deixando as bases nitrogenadas expostas e formando o que chamamos de forquilha de replicação. A dupla-hélice é separada por meio da atuação da enzima DNA helicase. Conforme a helicase vai abrindo a dupla-hélice, há um aumento da tensão nas extremidades da molécula, à semelhança do que ocorre quando dois cadarços enrolados um sobre o outro, que tem suas pontas pertencentes à mesma extremidade e que são puxadas em direções opostas. Para diminuir essa tensão, evitando o emaranhamento da molécula de DNA, enzimas chamadas DNA topoisomerases participam do processo. Elas quebram as ligações fosfodiéster do DNA pela adição covalente de um fosfato. Essa reação é reversível, uma vez que a ligação covalente que une a topoisomerase ao DNA retém a energia da ligação fosfodiéster que foi rompida.

 Com a helicase abrindo a dupla-hélice de DNA pelo rompimento das pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas, seria natural que elas tendessem a se parear novamente, logo após a passagem da helicase. Para evitar isso, moléculas especiais chamadas genericamente de proteínas ligadoras de fita simples se ligam à dupla-hélice aberta, impedindo o repareamento das bases.

Vamos agora verificar como o DNA é efetivamente copiado em uma nova molécula, criando dessa forma, duas novas moléculas de DNA.

A enzima responsável pela síntese de uma nova cadeia polinucleotídica é a DNA polimerase, como já destacado na aula anterior. A síntese do DNA é iniciada em locais específicos da molécula, chamados de forquilhas de replicação. São nessas forquilhas que as enzimas helicase e as demais dos complexos iniciaram seu trabalho. Estudos realizados nos anos 60 demonstraram que a forquilha de replicação é assimétrica. Isso ocorre devido ao fato de as fitas de DNA serem antiparalelas, ou seja, uma das fitas é orientada na direção 5' → 3', enquanto a outra é orientada na direção oposta, ou seja, 3' → 5'. Assim, era de se esperar que existissem dois tipos de DNA polimerase, uma sintetizando o DNA em cada sentido. Entretanto, só existe um tipo de DNA polimerase, a qual sintetiza a cadeia polinucleotídica na direção 5' → 3'. Assim, ela se liga à cadeia 3' → 5', dando início ao seu trabalho.

Como vimos, existe apenas um tipo de DNA polimerase que é capaz de se trabalhar na direção 5' → 3'. Então, como seria realizada a síntese de DNA da fita oposta? Para contornar esse problema, a célula utiliza um mecanismo de “costura para trás”. A DNA polimerase liga-se ao DNA a uma determinada distância da extremidade da abertura da forquilha de replicação, passando a sintetizar a nova cadeia em direção a essa extremidade, ou seja, de trás para frente. Com isso, temos milhares de pontos de união entre os trechos sintetizados aos poucos. Esses trechos são unidos uns aos outros pela enzima DNA ligase e recebem o nome de fragmentos de Okasaki.

Temos então duas fitas sendo sintetizadas ao mesmo tempo. Entretanto, a fita em que a DNA polimerase realiza o processo de “costura para trás” (fita 5' → 3') demora mais tempo para ser totalmente sintetizada, ao passo que a fita 3' → 5' é lida mais rápido e tem sua cadeia complementar sintetizada mais rápido também. Assim, a fita 3' → 5' é chamada de fita líder, enquanto a fita 5' → 3' é chamada fita retardada.

Embora pareça um processo complicado e sujeito a mais erros, o fato da DNA polimerase catalisar a reação de polimerização apenas no sentido 5' → 3' é de extrema importância para a realização de uma cópia com alta taxa de fidelidade. Essa taxa de fidelidade é de apenas um erro para cada 10⁹ pares de bases copiadas. Levando-se em conta que o genoma de um mamífero possui cerca de 3.10⁹ pares de bases, é de se esperar que ocorram apenas 3 erros no genoma a cada ciclo de divisão celular. Essa alta fidelidade é devido à DNA polimerase ser autocorretiva, ou seja, antes de adicionar o próximo nucleotídeos trifosfatado à cadeia crescente, ela verifica se o nucleotídeos adicionado anteriormente está corretamente pareado. Essa capacidade da DNA polimerase ser autocorretiva é devido a ela apenas sintetizar uma cadeia polinucleotídica apenas no sentido 5' → 3'. Caso ela sintetizasse em ambos sentidos, perderia essa capacidade de verificação, resultando em um acúmulo de mutações muito maior do que encontramos na célula hoje.

A imagem acima esquematiza o processo de replicação do DNA. Como vimos, as duas fitas de DNA são fielmente copiadas, dando origem a duas novas fitas. Em cada uma dessas duplas-hélices novas temos uma fita que serviu de molde para a síntese da outra fita. Assim temos que a replicação do DNA é semiconservativa, ou seja, metade das fitas são conservadas na molécula. A descoberta do funcionamento do processo de replicação do DNA, junto com o avanço da tecnologia, permitiu aos cientistas desenvolverem máquinas que fazem exatamente o que ocorre dentro da célula. Um exemplo disso foi o desenvolvimento de uma técnica chamada PCR (Polimerase Chain Reaction – Reação da Cadeia da Polimerase). Dentro de uma máquina, o DNA obtido de apenas uma única célula é replicado milhares de vezes, produzindo quantidades suficientes de DNA para análise. Isso é particularmente importante em criminalística, onde a presença de uma pequeníssima mancha de sangue deixa um “impressão genética” do indivíduo. Outra aplicação ocorrem em casos de suspeita de paternidade. O teste de DNA é realizado com células presentes no bulbo capilar, do sangue ou da própria mucosa da boca. Para evitar a remoção de muito tecido, utiliza-se a PCR para amplificar a quantidade de DNA obtida.

Animação da Replicação do DNA